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分子遺伝学（菱田研究室）

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DNA相同組換えの分子メカニズムの解明とその応用

DNA組換え反応は、バクテリアからヒトまで高度に保存された反応であり、体細胞、減数分裂細胞、免疫細胞、さらにはバイオテクノロジーの分野において様々な役割を果たしている。例えば、体細胞においては、放射線や変異源物質などによって生じるDNA二本鎖切断の修復をはじめ、DNA複製阻害の解消やテロメア構造の維持など、染色体の安定性維持に重要な役割を果たしている。免疫細胞や減数分裂細胞では、それぞれ抗原受容遺伝子の組換えや相同染色体間の組換えなどで中心的な役割を果たしており、これらはいずれも多様性の獲得に貢献している。このように、DNA組換えは、遺伝情報の本体であるゲノムに対して「安定と変化」をもたらす両面の働きを持っている。私たちの研究室では、出芽酵母及び大腸菌をモデル生物として用いて、DNA相同組換えの分子メカニズムを詳細に解析し、ゲノム安定性維持機構の解明を目指している。

DNA相同組換えの様々な役割

DNA相同組換え経路

DNA相同組換えの制御メカニズムの解明

DNA相同組換え反応は、DNAヘリケース、ヌクレアーゼ、DNA鎖交換タンパク質の他、様々なアクセサリータンパク質が関与しており、その反応は、ATP加水分解のエネルギーを利用する多段階からなる機械的反応である。その中でもDNAヘリケースなどのDNAモータータンパクは、組換え制御因子として中心的な役割を果たしている。我々の研究室では、Sgs1、Srs2、Mgs1などのDNA二重鎖を巻き戻す（巻き直す）活性を持つタンパク質に着目し、これらがDNA相同組換え制御において果たす役割を解析している。特に、出芽酵母Sgs1タンパク質は、大腸菌からヒトまで高度に保存され、ヒトのSgs1ホモログであるBLM及びWRNは、それぞれ高発癌性のブルーム症候群や早期老化が現れるウェルナー症候群の原因遺伝子産物であることから、これらの分子メカニズムの解明が発がんや老化の分子基盤の解明につながるものとして期待されている。

DNA二重鎖切断に伴う染色体動態制御機構の解析

放射線や細胞内の活性酸素などの外的、内的要因によって引き起こされるDNA二本鎖切断は、染色体構造の不安定化を引き起こす要因となりうるため、その修復機構は染色体の構造と機能（動態）を制御する機構と密接に関わっていると考えられる。SMC(structural maintenance of chromosomes：染色体構造維持)ファミリーに属するタンパク質群は、真性細菌、古細菌、及び真核生物に存在し、染色体の動態制御に関わるマシナリーとして重要な役割を果たしていると考えられているが、DNA二本鎖切断時にどのように働くかはわかっていない。私たちは、SMCスーパーファミリーに属するタンパク質群のDNA損傷修復への関与に注目し、DNA二本鎖切断修復における染色体レベルでの制御メカニズムの解析を行っている。

遺伝子ターゲティングの人為的制御技術の開発

遺伝子ターゲティングとは、DNA相同組換えを利用して染色体上の目的とする遺伝子の破壊や改変をする方法であり、トランスジェニックマウスやiPS細胞、組換え植物などの様々な研究分野で基幹となる技術の一つである。しかしながら、ヒトや植物をはじめとする多くの高等真核生物では、相同組換えが起きる確率がきわめて低いために、ゲノム上のランダムな箇所に外来DNA断片が挿入されてしまうことが大きな問題となっている。本研究では、遺伝子ターゲティング効率が極めて高い出芽酵母をモデル生物として、DNA相同組換えに関わる新規因子や制御メカニズムの解析をすすめ、これらの情報を基に遺伝子ターゲティングの分子メカニズムの解明や人為的に制御する技術シーズの創出を目指している。さらに、これらの技術をニワトリやマウス、ヒトの細胞などへ応用することで、新たな遺伝子ターゲティング法の開発を目指している。

DNA損傷ストレス耐性の分子メカニズム

生物の遺伝情報を担うゲノムDNA は、電離放射線、紫外線、化学物質などの外的要因の他、細胞活動等によって発生する活性酸素などの内的要因によって絶えず損傷を受けている。そのため生物は、これらのDNA損傷ストレスに対する様々な損傷応答機構を進化の過程で獲得してきている。自然環境には様々なDNA損傷ストレスが存在しており、これらに共通する点は、微量かつ慢性的にゲノム上で発生しているということである。生物は、この微量かつ慢性的な損傷ストレスに対して耐性を獲得することで地球環境に適応してきた一方で、このような長きに渡る損傷への暴露がヒトの発がんや老化と密接に関連していると考えられている。したがって、このような損傷ストレスへの暴露が生物に与える影響を理解し、その防御機構を理解することは非常に重要な問題である。当研究室では、出芽酵母と大腸菌をモデル生物として用い、個々の損傷応答機構の連携によって形成されるDNA損傷応答システムの解明を目指して研究を行っている。さらに、これらのシステムの破綻が引き起こすゲノム不安定性を詳細に解析し、ヒトにおける様々なゲノム不安定に起因する疾患の分子レベルでのメカニズムを明らかにすることで、それらの生物学的・医学的意義を統合的に理解することを目指している。

紫外線損傷による複製阻害と損傷応答

慢性的な損傷ストレスに対する耐性獲得の分子メカニズムの解析

損傷応答機構には、DNA損傷を修復する機構の他に、程度に応じて細胞周期や遺伝子発現などを制御する損傷チェックポイント機構や、DNA修復を伴わずに複製阻害のバイパスを促進するDNA損傷トレランス機構などが知られている。実際の生体内では、これらの機構が独立に機能するのではなく、DNA損傷ストレスに対して連携しながら、細胞の増殖とゲノムの安定性を維持する一つのシステムとして機能しているため、生理的な意義やシステムの理解には自然環境に類似した環境下で研究を行うことが非常に重要であると考えられる。最近、当研究室では、自然環境レベルの紫外線照射下で酵母細胞を培養する装置を独自に開発し、慢性的なDNA損傷ストレス環境における細胞の損傷応答システムを詳細に解析している。

PCNAのユビキチン化制御の分子機構

DNA損傷による複製フォークの進行阻害が起こった場合、複製の再開にDNA損傷の修復を待っていてはDNA複製の完了に膨大な時間が必要となってしまう。そのような事態を回避するために、DNA損傷を残したまま複製フォークが損傷部位を乗り越えるDNA損傷トレランスと呼ばれる機構が存在する。DNA損傷トレランスの機能は、DNA損傷の修復を行わずに複製阻害部位の回避に働くことから、高等生物においては発がんなどの原因となるゲノム不安定性を増大させる可能性があるため厳密な制御の下で機能することが必要である。このDNA損傷トレランスの制御には、ユビキチン化と呼ばれる翻訳後修飾が重要な役割を果たしており、DNA複製阻害が引き起こされると、DNA複製装置に含まれるPCNA（DNAクランプ）というタンパク質がユビキチン化修飾を受け、損傷トレランス経路を活性化することが知られている。さらに、この修飾にはユビキチンタンパク質が１つだけ結合したモノユビキチン化と複数のユビキチンがポリマー状に結合しているポリユビキチン化の２つの修飾形態が存在し、それぞれ別の損傷トレランス経路を活性化している。このユビキチン化修飾の制御機構や複製阻害部位のバイパス機構に関しては、未だ不明な点が多く残されており、現在詳細な解析を行っている。

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生命科学科（学部）、生命科学専攻（大学院）兼務

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